蓖麻毒素毒性作用研究論文

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蓖麻毒素作為免疫毒素中最常應(yīng)用的毒素之一伴隨著腫瘤導(dǎo)向治療的研究受到了國(guó)內(nèi)外的重視，對(duì)其毒性作用的認(rèn)識(shí)也不斷深化。以往認(rèn)為蓖麻毒素僅是單一的蛋白質(zhì)合成抑制劑，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，除此之外它還具有誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子，引起脂質(zhì)過氧化及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

一、蓖麻毒素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

蓖麻毒素是從蓖麻籽中提取的植物糖蛋白，分子量64000。毒素由A和B兩條多肽鏈組成，兩鏈間由一個(gè)二硫鍵連接。目前，A鏈和B鏈的氨基酸序列以及二級(jí)結(jié)構(gòu)已基本清楚。毒素B鏈上含有兩個(gè)半乳糖或半乳糖殘基結(jié)合位點(diǎn)，可和細(xì)胞表面的含半乳糖殘基的受體結(jié)合，通過內(nèi)陷作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，發(fā)揮毒性作用。蓖麻毒素A、B鏈上還分別含有1和2個(gè)糖支鏈，鏈末端均為甘露糖殘基［1］，可以和網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞特別是巨噬細(xì)胞結(jié)合。后者細(xì)胞表面富含甘露糖受體，可優(yōu)先攝取蓖麻毒素，這對(duì)于毒素發(fā)揮生物功能有重要的作用。

二、蓖麻毒素毒性作用機(jī)理

1.抑制蛋白質(zhì)合成：蓖麻毒素具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，屬于蛋白合成抑制劑或核糖體失活劑，這也是在構(gòu)建免疫毒素時(shí)，應(yīng)用到蓖麻毒素的主要原因。毒素抑制蛋白合成的機(jī)理在70年代已經(jīng)明確，以后略有補(bǔ)充［2，3］。首先，毒素依靠B鏈上的半乳糖結(jié)合位點(diǎn)與細(xì)胞表面含末端半乳糖殘基的受體結(jié)合，促進(jìn)整個(gè)毒素分子以內(nèi)陷方式進(jìn)入細(xì)胞，形成細(xì)胞內(nèi)囊，毒素從細(xì)胞內(nèi)囊中進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，隨后蛋白鏈間二硫鍵被還原裂解，游離出A鏈。A鏈?zhǔn)且环N蛋白酶，作用于真核細(xì)胞核糖體60S大亞單位的28SrRNA，水解A4324位點(diǎn)的腺嘌呤N-糖甙甙鍵，使其脫去腺嘌呤，喪失抗RNA酶的抗性而被降解，不能與延長(zhǎng)因子(EF-2)結(jié)合，從而干擾了核糖體，EF-2，鳥嘌呤三磷酸腺苷(GTP)復(fù)合體的形成，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的抑制，最終細(xì)胞死亡。已引起研究者注意的是：①B鏈對(duì)A鏈發(fā)揮毒性具有重要的促進(jìn)作用。②在細(xì)胞內(nèi)鏈間二硫鍵的還原裂解對(duì)毒素發(fā)揮毒性作用具有重要作用。③最新的研究表明：B鏈上的半乳糖結(jié)合位點(diǎn)也參與了毒素的體內(nèi)毒性［4］。

2.誘導(dǎo)細(xì)胞因子的損傷作用：蓖麻毒素中毒損傷的許多癥狀，不能完全由抑制蛋白質(zhì)合成來解釋，促使學(xué)者探討其新的毒性作用機(jī)理。1986年，Tracey等［5］發(fā)現(xiàn)蓖麻毒素中毒大鼠的腸道損傷類似TNF/Chchectin處理的大鼠腸道。1991年Nadkami和Deshphude認(rèn)為蓖麻毒素中毒后的許多現(xiàn)象，例如：發(fā)熱，肝出血性壞死，腹水，胸水的滲出，腸道的出血壞死性炎癥等等早期的急性反應(yīng)都與腫瘤壞死因子(TNF-α)，白細(xì)胞介素(IL-1)，IL-6的分泌有關(guān)。1993年，Licastro等［6］檢測(cè)到蓖麻毒素誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的外周血單核細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β，同時(shí)在蓖麻毒素中毒大鼠的血漿中亦可檢測(cè)到低水平的TNF-α。1994年Mudlooon等［7］發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)注射抗TNF的抗體，將明顯降低蓖麻毒素對(duì)小鼠的氧化損傷。1997年，董巨瑩等［8］亦報(bào)道了TNF在蓖麻毒素中毒小鼠肝臟的免疫組織化學(xué)定位。細(xì)胞因子參與機(jī)體損傷的另一個(gè)例子是：對(duì)于由蓖麻毒素構(gòu)建的免疫毒素1，2期臨床試驗(yàn)中病人出現(xiàn)的副作用：包括發(fā)熱、肌痛、毛細(xì)血管滲漏綜合癥等可以通過封閉或拮抗這些細(xì)胞因子的功能而減輕［6］。

蓖麻毒素誘導(dǎo)細(xì)胞因子的機(jī)理目前多數(shù)認(rèn)為是通過刺激淋巴樣細(xì)胞產(chǎn)生的。主要為巨噬細(xì)胞和肝Kupffer′s細(xì)胞。這些細(xì)胞表面含有甘露糖受體，可與蓖麻毒素分子中3個(gè)末端甘露糖殘基特異結(jié)合而優(yōu)先被攝取。蓖麻毒素誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌有劑量和時(shí)間依賴性。毒素是否可誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及各細(xì)胞因子之間是否具有網(wǎng)絡(luò)免疫調(diào)節(jié)的作用，尚待探討。

3.脂質(zhì)過氧化損傷作用：蓖麻毒素與巨噬細(xì)胞的相互作用，不僅誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，而且誘導(dǎo)產(chǎn)生自由基和活性氧，引起脂質(zhì)過氧化作用。1991年，Muldoon和Stohes［9］發(fā)現(xiàn)蓖麻毒素可以誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化作用，結(jié)果導(dǎo)致尿液中丙二醛、甲醛、丙酮的含量增加。1992年的研究表明［10］，各臟器中脂質(zhì)過氧化強(qiáng)度(MDA含量)，還原型谷胱甘肽的減少以及DNA單鏈斷裂程度在毒素中毒36小時(shí)后最為強(qiáng)烈，且肝臟的損傷最為嚴(yán)重。結(jié)合以往的研究［11］：谷胱甘肽的使用可以部分對(duì)抗致死劑量的毒素效應(yīng)，具有潛在的化學(xué)保護(hù)作用，因此，Muldoon等［10］認(rèn)為蓖麻毒素引起的氧化作用可以歸屬到蓖麻毒素的毒性機(jī)理中去。

許多毒物可以通過激活巨噬細(xì)胞分泌ROS(reactiveoxygenspecies)和TNF誘發(fā)氧化作用。已有的研究表明［7，12］：TNF-α抗體，鐵離子對(duì)蓖麻毒素誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和氧化損傷起重要的調(diào)節(jié)作用。給小鼠注射抗TNF-α的抗體，可以明顯降低尿液丙二醛，甲醛，丙酮的含量。鐵離子以及去鐵敏(desferrioxamine)的摻入，可分別增加和減少蓖麻毒素誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化的水平。蓖麻毒素引起體內(nèi)氧化損傷的機(jī)理還待更深入的探討。

4.蓖麻毒素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：壞死和凋亡是細(xì)胞死亡的兩種方式。在引起細(xì)胞凋亡的三大類因素中，毒素，抗癌藥物是其中之一。以往認(rèn)為化療藥物是通過引起靶細(xì)胞發(fā)生不可逆代謝障礙而殺死腫瘤細(xì)胞，近年來認(rèn)為是通過改變生理環(huán)境而誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生PCD(programmedcelldeath)而達(dá)到療效。1989年，Leek等［13］報(bào)道：在蓖麻毒素中毒的腸道病理研究中利用免疫組織化學(xué)和電子顯微鏡觀察到腸道上皮細(xì)胞的胞漿中存在凋亡樣的變化。1990年，Waring報(bào)道［14］；蓖麻毒素可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，未成熟T細(xì)胞出現(xiàn)DNA破碎(DNAfragmentation)，而后者被認(rèn)為是與凋亡有關(guān)的生化改變之一。1991年，他們報(bào)道了蓖麻毒素誘導(dǎo)上皮樣細(xì)胞發(fā)生凋亡樣的形態(tài)學(xué)改變。1996年，F(xiàn)u等［4］報(bào)道了蓖麻毒素可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)甲狀腺，脾臟的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。

凋亡的發(fā)生與一些凋亡相關(guān)基因的開放和凋亡蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)。蓖麻毒素作為蛋白合成抑制劑又如何誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡呢?兩者是否矛盾呢?已有的實(shí)驗(yàn)證實(shí)［14］：蓖麻毒素等蛋白質(zhì)合成抑制劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制與它們抑制蛋白合成作用無關(guān)，亦不需要Ca2+依賴性核酸內(nèi)切酶的參與，而是與其升高細(xì)胞內(nèi)的三磷酸肌醇水平有關(guān)。另外，有報(bào)道［15］：巨噬細(xì)胞的粘附可以阻止蓖麻毒素誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生。蓖麻毒素的抗吞噬細(xì)胞作用可能直接導(dǎo)致DNA斷裂和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。資料表明：引起細(xì)胞壞死的有害因素在強(qiáng)度很大時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞壞死，但強(qiáng)度較小時(shí)卻引起細(xì)胞發(fā)生凋亡［16］。蓖麻毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也存在明顯的劑量依賴性［15］。總之，蓖麻毒素誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡與傳統(tǒng)的蓖麻毒素作為蛋白質(zhì)合成抑制劑并不構(gòu)成矛盾，有可能對(duì)現(xiàn)有的凋亡理論是一種非常關(guān)鍵的補(bǔ)充和完善。

三、總結(jié)和展望

蓖麻毒素的毒性具有明顯的劑量依賴性，毒素誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，引起體內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷以及誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡等等都是在小劑量范圍內(nèi)具有的，而大劑量的蓖麻毒素仍主要表現(xiàn)為抑制蛋白質(zhì)合成的毒性。毒素誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生及引起體內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷的作用，均與其糖鏈末端甘露糖殘基被巨噬細(xì)胞特異性攝取，并激活巨噬細(xì)胞有關(guān)，是毒素?fù)p傷的繼發(fā)作用。蓖麻毒素等蛋白質(zhì)合成抑制劑誘導(dǎo)凋亡的理論研究對(duì)現(xiàn)有的凋亡理論可能會(huì)有重要的補(bǔ)充價(jià)值。

蓖麻毒素的毒性作用機(jī)理研究，特別是近幾年的研究進(jìn)展，豐富了人們對(duì)蓖麻毒素毒性作用的認(rèn)識(shí)，為蓖麻毒素抗癌研究進(jìn)一步提供了理論依據(jù)和新的思路。

本課題受國(guó)家自然科學(xué)基金資助(編號(hào)：39500122)

作者單位：710032西安市第四軍醫(yī)大學(xué)毒理學(xué)教研室

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