微生物領(lǐng)域研究分析論文

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論文關(guān)鍵詞：代謝組學(xué)環(huán)境微生物評(píng)述

論文摘要：代謝組學(xué)是效仿基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思想,對(duì)生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析,并尋找代謝物與生理病理變化的相對(duì)關(guān)系的研究方式。本文在介紹代謝組學(xué)基本含義的基礎(chǔ)之上，對(duì)代謝組學(xué)的研究方法及其在環(huán)境微生物領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述。

一、代謝微生物概述

代謝組學(xué)(metabonomics/metabolomics)是效仿基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思想,對(duì)生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析,并尋找代謝物與生理病理變化的相對(duì)關(guān)系的研究方式,是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分。其研究對(duì)象大都是相對(duì)分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)。先進(jìn)分析檢測(cè)技術(shù)結(jié)合模式識(shí)別和專家系統(tǒng)等計(jì)算分析方法是代謝組學(xué)研究的基本方法?；瘜W(xué)分析技術(shù)中最常用的是1H核磁共振(1HNMR)以及色譜(毛細(xì)管電泳)-質(zhì)譜聯(lián)用(X-MS)。目前代謝組數(shù)據(jù)處理的主要方法是:應(yīng)用主成分分析(PCA)等將從原始圖譜信息或預(yù)處理后的信息進(jìn)行歸類,并采用相應(yīng)的可視化技術(shù)直觀地表達(dá)出來(lái);建立類別間的數(shù)學(xué)模型,使各類樣品間達(dá)到最大的分離,并利用建立的多參數(shù)模型對(duì)未知的樣本進(jìn)行預(yù)測(cè);最終建立可利用的該領(lǐng)域的應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)和專家系統(tǒng)。應(yīng)用代謝組學(xué)可進(jìn)行疾病診斷、對(duì)藥物進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)和研究植物細(xì)胞代謝等。

二、代謝組學(xué)的研究方法

代謝物組學(xué)分析中,對(duì)于不同類型的代謝產(chǎn)物,往往要采取不同的分析方法進(jìn)行研究。目前,代謝物組學(xué)通常采用紅外光譜法(infraredspectroscopy,IR)、核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)、質(zhì)譜(massspectrometry,MS)、高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography,HPLC)以及各種技術(shù)的耦聯(lián),如氣象色譜耦聯(lián)質(zhì)譜(gaschromatography2massspectrometry,GC/MS)和液相色譜耦聯(lián)質(zhì)譜(liquidchromatography2massspectrometry,LC/MS)來(lái)分析研究代謝物并為其繪制圖譜。這些技術(shù)的耦聯(lián)可以提高對(duì)樣品的分辨率、敏感性及選擇度,有利于對(duì)更多的生物體系內(nèi)的代謝物繪制圖譜。一般來(lái)說(shuō),選擇代謝物組學(xué)分析方法時(shí),其原則是要同時(shí)考慮儀器和技術(shù)的檢測(cè)速度、選擇性和靈敏度,找到一種最適合目標(biāo)化合物的方法。

三、代謝組學(xué)在微生物領(lǐng)域的研究進(jìn)展

(一)微生物分類,突變體篩選以及功能基因研究

經(jīng)典的微生物分類方法多根據(jù)微生物形態(tài)學(xué)以及對(duì)不同底物的代謝情況進(jìn)行表型分類。最近,隨著分子生物學(xué)的突飛猛進(jìn),基因型分類方法如16SrDNA測(cè)序,DNA雜交以及PCR指紋圖譜等方法得到了廣泛應(yīng)用。然而,某些菌株按照基因型與表型兩類方法分類會(huì)得出不同的結(jié)果。因此,根據(jù)不同的分類目的聯(lián)合應(yīng)用這兩類方法已成為一種趨勢(shì)。BIOLOG等方法在表型分類中應(yīng)用較為廣泛,但是,代謝譜分析方法(metabolicprofiling)異軍突起,逐漸成為一種快速、高通量,全面的表型分類方法。采用代謝組分類時(shí),可以通過(guò)檢測(cè)胞外代謝物來(lái)加以鑒別。常用的胞外代謝物檢測(cè)方法為樣品衍生化后進(jìn)行GC2MS分析、薄層層析或HPLC2MS分析,最后通過(guò)特征峰比對(duì)進(jìn)行分類。Bundy等采用NMR分析代謝譜成功地區(qū)分開(kāi)臨床病理來(lái)源以及實(shí)驗(yàn)室來(lái)源的不同桿菌(bacilluscereus)。除了表型分類外,代謝組學(xué)數(shù)據(jù)可以應(yīng)用于突變體的篩選。在傳統(tǒng)研究中的沉默突變體(即未發(fā)生明顯的表型變化的突變體)內(nèi),突變基因可能導(dǎo)致了某些代謝途徑發(fā)生變化,通過(guò)代謝快照(metabolicsnapshot)可以發(fā)現(xiàn)該突變體并研究相應(yīng)基因的功能。

(二)發(fā)酵工藝的監(jiān)控和優(yōu)化

發(fā)酵工藝的監(jiān)控和優(yōu)化需要檢測(cè)大量的參數(shù),利用代謝組學(xué)研究工具可以減少實(shí)驗(yàn)數(shù)量,提高檢測(cè)通量,并有助于揭示發(fā)酵過(guò)程的生化網(wǎng)絡(luò)機(jī)制,從而有利于理性優(yōu)化工藝過(guò)程。Buchholz等采用連續(xù)采樣的方法研究了大腸桿菌在發(fā)酵過(guò)程中的代謝網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)力學(xué)變化。他們?cè)谄咸烟侨狈Φ呐囵B(yǎng)液培養(yǎng)的大腸桿菌中加入葡萄糖,并迅速混勻,按每秒4～5次的頻率連續(xù)取樣。利用酶學(xué)分析、HPLC/LC2MS等手段監(jiān)測(cè)樣品中多達(dá)30種以上的代謝物、核苷以及輔酶,從而解析了葡萄糖以及甘油的代謝途徑和底物攝取體系。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析建模,發(fā)現(xiàn)在接觸葡萄糖底物后的15～25s范圍內(nèi),大腸桿菌體內(nèi)發(fā)生的葡萄糖代謝物變化與經(jīng)典生化途徑相符,但隨后的過(guò)程則與經(jīng)典途徑不符,推測(cè)可能存在新的未知調(diào)控步驟。Takors認(rèn)為,通過(guò)上述代謝動(dòng)力學(xué)研究,掌握代謝途徑及網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵參數(shù),將直接有利于代謝工程的優(yōu)化,包括菌株的理性優(yōu)化以及發(fā)酵參數(shù)的調(diào)控。

(三)環(huán)境微生物研究

微生物降解是環(huán)境中去除污染物的主要途徑。深入了解污染物在微生物內(nèi)的代謝途徑,將有助于人們優(yōu)化生物降解的條件,從而實(shí)現(xiàn)快速的生物修復(fù)。這些代謝中間體大都通過(guò)萃取、分析方法進(jìn)行逐個(gè)研究,并借助專家經(jīng)驗(yàn)擬合出代謝途徑,其動(dòng)力學(xué)過(guò)程亦很少觸及。代謝組學(xué)方法的采用有可能改變這一現(xiàn)狀。Boersma等采用代謝組學(xué)方法研究氟代酚的微生物降解途徑。氟代化合物具有特殊的19F核磁共振屬性,19F的核磁共振靈敏度與1H核相近;由于生物體內(nèi)無(wú)內(nèi)源性19F核磁信號(hào),因而無(wú)本底干擾。所有19F核磁信號(hào)均可歸結(jié)于異生素及其代謝物。19F核的化學(xué)位移值寬,約為700ppm(1H為15ppm,13C為250ppm)。較寬的化學(xué)位移導(dǎo)致19F在不同取代物的峰圖不易產(chǎn)生重疊。因此,借助核磁共振技術(shù)可以更方便地研究含氟化合物的代謝中間體。Boersma等根據(jù)總代謝物的核磁共振圖譜,推測(cè)出紅球菌內(nèi)羥化酶在不同的取代位(1,2,3三種不同的取代數(shù)量)羥基化氟代酚,然后再通過(guò)兒茶酚內(nèi)位雙加氧酶開(kāi)環(huán)形成氟代粘糠酸的代謝過(guò)程。此外,他們還首次檢測(cè)到開(kāi)環(huán)后的下游代謝物,即通過(guò)氯粘糠酸異構(gòu)酶生成氟代粘糠酸內(nèi)酯以及氟代馬來(lái)酸等中間代謝物。根際(rhizosphere)空間在植物2微生物相互作用中發(fā)揮著重要的作用。Narasimhan等利用根際代謝物組(rhizospheremetabolomics)方法,闡釋了植物分泌物對(duì)根際微生物降解多氯代酚(PCB)的作用機(jī)制。然而,在采用擬南芥突變體(產(chǎn)生較少的phenylpropanoids)的對(duì)照組中,降解菌的數(shù)量較低,降解率也僅達(dá)50%。結(jié)果表明植物根際分泌的次級(jí)代謝物促進(jìn)降解菌的繁衍增殖,從而促進(jìn)了污染物的降解。

此外,微生物代謝組學(xué)還應(yīng)研究如何改進(jìn)樣品的制備方法。例如,在代謝組研究中,為了中止細(xì)胞代謝反應(yīng)采用冷淬火(coldquenching)方法,將細(xì)胞樣品迅速置于低溫(液氮或-70℃甲醇中),這會(huì)導(dǎo)致許多微生物發(fā)生冷休克(cold2shock),釋放出大量的胞內(nèi)物質(zhì),引起代謝組學(xué)定量研究發(fā)生偏差。

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