深究組織工程微粒皮膚的構(gòu)建及其性能

導(dǎo)語(yǔ)：深究組織工程微粒皮膚的構(gòu)建及其性能一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢(xún)客服老師，歡迎參考。

摘要：目的探索利用人成纖維細(xì)胞和York豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)微粒復(fù)合構(gòu)建組織工程微粒皮膚的可行性并對(duì)其進(jìn)行初步研究。方法體外培養(yǎng)取自胎背的人成纖維細(xì)胞，用PKH26標(biāo)記，將細(xì)胞與ADM微粒復(fù)合構(gòu)建微粒皮膚，用熒光顯微鏡觀察、電鏡觀察和MTT法檢測(cè)組織工程微粒皮膚的性能。結(jié)果脫細(xì)胞真皮基質(zhì)微粒均勻柔軟，彈性、韌性好，三維結(jié)構(gòu)完整且排列規(guī)則。細(xì)胞與ADM微粒的復(fù)合情況良好，2h后開(kāi)始黏附，2d后增殖明顯，10d增殖達(dá)到高峰；7d時(shí)取材，HE和SEM顯示成纖維細(xì)胞在ADM微粒表面成層黏附，并分泌大量基質(zhì)；細(xì)胞生長(zhǎng)良好。結(jié)論利用人成纖維細(xì)胞和York豬的ADM微?？梢詷?gòu)建具有活性的組織工程微粒皮膚。

關(guān)鍵詞：組織工程微粒皮膚脫細(xì)胞真皮基質(zhì)成纖維細(xì)胞

皮膚是覆蓋與保護(hù)體表的重要組織器官。由于炎癥、潰瘍、外傷、燒傷、腫瘤術(shù)后及先天性畸形等原因常造成皮膚的缺損與異常。對(duì)于這種組織缺損目前多采用自體皮膚移植，這種方法不僅造成供皮區(qū)新的創(chuàng)傷缺陷，而且經(jīng)常受供皮來(lái)源的限制。隨著組織工程技術(shù)研究的深入，應(yīng)用組織工程皮膚修復(fù)皮膚缺損是目前皮膚缺損修復(fù)研究的熱點(diǎn)之一。脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(acellulardermalmatrix，ADM)是目前最有應(yīng)用前景的支架材料，它去除了引發(fā)宿主排斥反應(yīng)的細(xì)胞成分，完整地保留了細(xì)胞外基質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和組成成分，力學(xué)性能好，抗原性低，可誘導(dǎo)具有再生能力的成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞按照應(yīng)有的組織學(xué)方式長(zhǎng)入真皮層，其臨床應(yīng)用效果最好，并且其在體內(nèi)降解吸收與宿主組織改建相一致。筆者在實(shí)驗(yàn)中借鑒燒傷治療中的微粒皮技術(shù)，利用改良消蝕法(另文發(fā)表)制備相容性良好的ADM微粒，與成纖維細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建組織工程微粒皮膚，以期延展組織工程在皮膚缺損修復(fù)上的應(yīng)用前景。

一、材料與方法

1、材料

York豬(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)；DMEM低糖培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma公司)；胰酶(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；超凈工作臺(tái)(Nuair公司)；CO2孵箱(Nuair公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司)；低溫高速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；培養(yǎng)板(Falcon公司)，；取皮鼓(無(wú)錫新達(dá)輕工機(jī)械有限公司)；恒溫箱(HHS21-4型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；掃描電子顯微鏡(TXA-840，日本電子光學(xué)公司)；真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(上海雷勃分析儀器有限公司MK3型酶標(biāo)儀)。

2、新型脫細(xì)胞真皮基質(zhì)微粒的制備

取York豬(20kg)新鮮背部皮膚，切成5cm×10cm大小，用取皮鼓反向取皮，去除含豬表皮面約0.3mm厚的皮片；將余下的豬真皮，再用取皮鼓同法于近表皮面取約0.3mm厚皮片，用質(zhì)量濃度2.5g/L胰蛋白酶消化90min，大量純水沖洗，然后將皮片用4%NaOH溶液消蝕，B型超聲清洗儀間斷振蕩清洗，每隔4h更換消蝕液1次，消蝕18h時(shí)將皮片取出，用滴加青、鏈霉素的PBS浸洗24h以上，其間多次換液，直至溶液變?yōu)榍辶?，pH7.2。最后將皮片放于-80℃冰箱，反復(fù)凍融3次，每次4h，使細(xì)胞完全破裂崩解。然后置冷凍干燥機(jī)凍干，再用物理方法切割成約0.3mm×0.3mm×0.3mm大小的ADM微粒，用PVC袋分裝、60Co照射、無(wú)菌保存。取部分材料用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，組織切片后常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色和掃描電鏡觀察，觀察ADM微粒的顏色、結(jié)構(gòu)和細(xì)胞殘留情況。

3、成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及擴(kuò)增

背部皮膚取自合法水囊引產(chǎn)的5月齡男胎，將其切成2mm×5mm的條塊，在4℃下用含100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的PBS浸泡沖洗，修剪多余的脂肪和肌肉組織，用質(zhì)量濃度2.5g/L胰酶4℃消化，機(jī)械分離表皮層和真皮層，將真皮層吹散，收獲其中的成纖維細(xì)胞，接種于75cm2的培養(yǎng)瓶中，用含100ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)并傳代，取2～9代生長(zhǎng)良好的成纖維細(xì)胞使用。

4、PKH26標(biāo)記成纖維細(xì)胞

細(xì)胞示蹤劑PKH26是親脂性的熒光染料，散發(fā)紅色熒光。它可以與細(xì)胞膜不可逆地結(jié)合，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記。按文獻(xiàn)所述方法，在nitName="℃">25℃條件下進(jìn)行，用質(zhì)量濃度2.5g/L胰酶消化對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。用PBS洗滌上述單細(xì)胞懸液，離心5min，小心吸去上清，加入1ml專(zhuān)用重懸液DiluentC重懸細(xì)胞，在染色之前即刻，在另一離心管中配制濃度4×10-6mol/L的PKH26染料。迅速均勻地將1ml重懸細(xì)胞液和1ml的染料液相混合，輕輕吹打、混勻，孵育2～5min。加入等量的血清終止反應(yīng)，放置1min，再加入等量的含血清DMEM。離心，移去上清，將細(xì)胞移入新的離心管中，用PBS洗滌3次。加入10mlDMEM洗滌細(xì)胞，培養(yǎng)、傳代。在熒光顯微鏡下檢查標(biāo)記的成纖維細(xì)胞染色效果和熒光強(qiáng)度，并觀察細(xì)胞的活力。

5、組織工程微粒皮膚的構(gòu)建

將制備好的ADM微粒用DMEM浸泡24h后，平鋪于12孔板中，以2×106/孔密度加入培養(yǎng)好的2～9代成纖維細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱中培養(yǎng)2周，每天換液，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，第3、7天取材HE染色，電鏡掃描。同法準(zhǔn)備另一鋪好ADM微粒的12孔板，加入同樣濃度PKH26標(biāo)記的成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞在微粒上的黏附、生長(zhǎng)情況。

6、細(xì)胞增殖檢測(cè)

在96孔板中，將成纖維細(xì)胞分別按2×103/孔接種在已滅菌處理好的ADM微粒上，加入DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)至100μl，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)照組直接接種細(xì)胞到孔板中，空白對(duì)照以100μlDMEM培養(yǎng)液代替細(xì)胞懸液接種，隔日換液。接種后第0、2、4、6、8、10、12天用MTT法測(cè)細(xì)胞在微粒上的增殖情況:先換無(wú)血清培養(yǎng)液80μl孵育2h，再加MTT(質(zhì)量濃度5mg/ml)20μl，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中4h后，棄去孔內(nèi)上清加DMSO100μl，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育10min，待沉淀溶解后在酶標(biāo)儀上讀取吸光度(A)值，檢測(cè)波長(zhǎng)570nm。根據(jù)A值繪出增殖曲線。每組56孔，每時(shí)相檢測(cè)點(diǎn)測(cè)8孔，重復(fù)4次。

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)A值均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，均數(shù)間兩兩比較采用Student-Newman-Keul(SNK)法，設(shè)定α=0.05。組間比較采用t檢驗(yàn)。

二、結(jié)果

1、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)微粒觀察

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)微粒外觀呈瓷白色，厚度為3000μm左右，表面(乳頭層側(cè))平整光滑(圖1a)，微粒均勻，質(zhì)地柔軟，有彈性，韌性好。鏡下觀察可見(jiàn)膠原纖維稍松散但排列規(guī)則，三維結(jié)構(gòu)完整(封二插圖圖1b)，真皮基質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)細(xì)胞及細(xì)胞碎片存在。掃描電鏡顯示，膠原纖維連續(xù)不斷，相互交織成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，排列整齊，分布均勻，孔隙直徑約20~50μm，孔隙間相互連通(圖1c)。

2、組織工程微粒皮膚的細(xì)胞生長(zhǎng)情況觀察

成纖維細(xì)胞在ADM微粒上2h即可黏附，2d后在微粒上開(kāi)始增殖，可以看見(jiàn)細(xì)胞在微粒上生長(zhǎng)良好(封二插圖圖2a)，7d時(shí)可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞以微粒為核心生長(zhǎng)數(shù)層并分泌大量基質(zhì)(封二插圖圖2b)。7d時(shí)，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)與ADM微粒復(fù)合的PKH26標(biāo)記的成纖維細(xì)胞數(shù)量增多(封二插圖圖"0"NumberType="1"Negative="False"HasSpace="False"SourceValue="2"UnitName="C">2c)。電鏡掃描顯示復(fù)合7d后，成纖維細(xì)胞在ADM微粒上生長(zhǎng)伸展良好(圖2d)。

3、組織工程微粒皮膚的細(xì)胞增殖情況檢測(cè)復(fù)合培養(yǎng)2、4、6、8、10、12d時(shí)微粒組成纖維細(xì)胞的增殖活力比較結(jié)果見(jiàn)圖3。由MTT結(jié)果可知，10d時(shí)組織工程微粒皮膚上的細(xì)胞與之前時(shí)間段相比增殖明顯(P<0.05)，特別是與2d時(shí)的增殖情況相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

三、討論

理想的人工真皮，其內(nèi)部應(yīng)具有一定孔徑和孔隙率，以利于組織中成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管的長(zhǎng)入，并且在移植后一段時(shí)間保持其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這樣既具有合適的被吸收率和降解速度，同時(shí)，又具有良好的創(chuàng)面黏附性。ADM作為天然的生物材料，保持了細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分及結(jié)構(gòu)，而脫去了細(xì)胞成分，從而最大限度地降低了免疫原性，且有較好的組織相容性，為其應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，并且ADM本身無(wú)毒性，其降解產(chǎn)物可被機(jī)體吸收，不對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害；同時(shí)，膠原的三維空間結(jié)構(gòu)具有一定的強(qiáng)度，是構(gòu)建組織工程支架的良好材料。作為永久性人工真皮支架，ADM已應(yīng)用于臨床，對(duì)改善創(chuàng)面的愈合提供了新的選擇。但由于ADM植入創(chuàng)面后血管化速度較慢，移植成分常因血供困難而愈合欠佳或壞死，特別是異種ADM的移植。因此，加速ADM血管化，對(duì)提高ADM支架的實(shí)用性，有著重要的臨床意義。研究表明，成纖維細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)和生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞增殖，利用成纖維細(xì)胞的這種特性，將成纖維細(xì)胞種植于人工支架上，可以降低排異反應(yīng)，增加生物親和性，促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)。Hansbrough等在PGA/PLA網(wǎng)上種植異體成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)2～3周，網(wǎng)孔中可被融合的成纖維細(xì)胞及其合成分泌的基質(zhì)填充，植入創(chuàng)面后易于血管化，適于與網(wǎng)狀皮片復(fù)合移植。但當(dāng)不種植成纖維細(xì)胞時(shí)，單純的PGA/PLA網(wǎng)血管化較慢，導(dǎo)致重疊移植的網(wǎng)狀皮片壞死。因此，在人工替代物中引入成纖維細(xì)胞，可提高生物親和性，加速新生血管形成。這可能與其分泌多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分，從而增強(qiáng)真皮替代物的親和性，促進(jìn)血管化有關(guān)。肖仕初等報(bào)道，在ADM上種植成纖維細(xì)胞構(gòu)建活性人工真皮，細(xì)胞基本上是在表面生長(zhǎng)，向支架內(nèi)部生長(zhǎng)緩慢。

筆者實(shí)驗(yàn)借鑒燒傷臨床的微粒皮技術(shù)，將成纖維細(xì)胞種植于自制的一種新型具有良好生物相容性的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)微粒上，期望能夠獲得一種血漿容易滲透、血管易于長(zhǎng)入、應(yīng)用方便的組織工程脫細(xì)胞真皮基質(zhì)微粒皮膚。從實(shí)驗(yàn)中可以看出，種植前2d，成纖維細(xì)胞在ADM微粒上能夠較好黏附，但增殖緩慢，之后細(xì)胞增殖明顯加快，10d時(shí)達(dá)到增殖高峰。這一點(diǎn)從細(xì)胞增殖曲線和熒光顯微鏡觀察結(jié)果也得到了印證。雖然細(xì)胞在ADM微粒上的增殖不如直接在培養(yǎng)板上生長(zhǎng)，但兩組細(xì)胞的增殖活性并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與其他相關(guān)報(bào)道的結(jié)果不完全一致。對(duì)HE顯微照片和電鏡照片觀察可見(jiàn)，構(gòu)建好的組織工程微粒皮膚上成纖維細(xì)胞呈多層生長(zhǎng)，并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，與天然皮膚的結(jié)構(gòu)相似。綜上所述，筆者在實(shí)驗(yàn)中所構(gòu)建的微粒皮膚是具有生物活性的組織工程產(chǎn)品，通過(guò)進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)有望擴(kuò)展組織工程皮膚的應(yīng)用范圍。